高鹽廢水是指總含鹽(如Na + 、K + 、Cl - 和SO4^2- 等)質(zhì)量分數(shù)≥1% 的廢水。近年來一些沿海城市積極開展海水的直接利用(如海水用于沖廁、沖洗道路、消防以及工業(yè)冷卻水等),預計到2020 年,全國海水直接利用量將達到1 × 109 m³ ·a - 1 ,海水直接利用量的快速增長是導致高鹽廢水大量排放的一個重要原因。目前,高鹽廢水較主要的處理方式是通過市政管網(wǎng)進入城市污水處理系統(tǒng)。高鹽廢水通常包含Na + 、K + 、Cl - 和SO4^2-等鹽類物質(zhì),這些離子濃度過高,會快速增大細胞滲透壓從而破壞菌體細胞,同時產(chǎn)生鹽析作用降低脫氫酶活性抑制細菌生長,而且高濃度的氯離子對細菌有一定地毒害作用。因此,高鹽廢水會對傳統(tǒng)污水生物處理工藝產(chǎn)生明顯的抑制作用,特別是在生物處理工藝的啟動期,活性污泥受到抑制會導致工藝出水水質(zhì)惡化,COD 和SS 濃度劇增。生物工藝處理高鹽廢水的較大問題在于微生物的代謝功能遭到破壞,原后生動物數(shù)量劇減,污泥馴化緩慢,反應器啟動時間較長。常麗麗等 研究了含鹽廢水生化處理耐鹽污泥馴化,發(fā)現(xiàn)馴化初期城市污水處理廠的污泥對含鹽廢水中COD 的去除率僅為30% ~ 40% ,經(jīng)過80 d 的馴化后COD 去除率才能達到90% 。宋晶等直接馴化嗜鹽菌處理高鹽廢水,采用序批式生物膜法(sequencing batch biofilm reactor, SBBR),通過逐步提高鹽度的方法模擬高鹽廢水的處理,出水COD 能夠達到90% 以上,但嗜鹽菌的馴化與擴培緩慢導致SBBR 很難快速啟動。HAMODA 等 研究發(fā)現(xiàn)高鹽環(huán)境并未完全抑制微生物生長,相反會促進一些嗜鹽細菌的生長;KARGI等發(fā)現(xiàn)通過投加嗜鹽微生物能夠加速微生物群落結構的演替,從而縮短污泥馴化的過程。通過投加復合菌劑進行生物強化成為了高鹽廢水處理研究的熱點。張波等制備復合嗜鹽菌劑強化處理高鹽有機廢水,中試實驗結果表明,投加復合嗜鹽菌劑能夠加快厭氧反應器的啟動,在70 d 內(nèi)就完成了啟動過程,且復合菌劑能夠有效改善生化系統(tǒng)對TOC 的去除效果,對TOC 的去除率由投菌前的50% 左右提高至70% 以上。大多數(shù)研究僅通過污染物去除效率來描述生物強化的效果,復合菌劑對活性污泥微生物群落機構演替的作用以及其能否在反應器中長期存留,均需要進一步研究與探討。

　　本研究依靠投加外源耐鹽高效復合菌劑,改善生物處理工藝啟動期處理效果,實現(xiàn)高鹽廢水生物處理工藝的快速啟動。采用分子生物學的方法分析啟動與完成階段活性污泥生物群落結構的變化,考察耐鹽高效復合菌劑在反應體系內(nèi)的存留時間,為開發(fā)高鹽廢水生物處理工藝提供技術支持。

　　1 實驗部分

　　1. 1 耐鹽高效菌與復合菌劑制備

　　耐鹽高效菌:本研究采用的耐鹽菌是由本實驗室篩選獲得的耐鹽高效菌O1 和Y5 ;地衣芽孢桿菌地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) O1 和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) Y5 均可降解高鹽廢水中的有機物,具有耐鹽、適用pH 值范圍寬、適用溫度范圍寬的特點。

　　LB 液體培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g,酵母粉5 g,NaCl 50 g,Milli-Q 水1 000 mL;LB 固體培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g,酵母粉5 g,NaCl 50 g,瓊脂15 g,Milli-Q 水1 000 mL;在LB 液體和固體培養(yǎng)基中分別加入45 g 和65 g的NaCl,配置含鹽量5% 和7% 的高鹽LB 培養(yǎng)基,用于復合菌劑的制備與擴培。

　　親水性聚氨酯生物填料:密度約為23 kg·m - 3 ,孔徑為2 ~ 3 mm,孔隙率> 90% ,比表面積23. 3 × 103m2 ·kg - 1 ,微生物負載量16 ~ 20 kg·m - 3 。

　　復合菌劑的制備:將已經(jīng)篩選獲得的耐鹽高效菌O1 和Y5 分別接種到鹽度為5% 和7% 的LB 液體培養(yǎng)基中,在25 ℃ 、150 r·min - 1 的條件下培養(yǎng),每隔2 h 測定OD600 ,當菌株Y1 和Q5 的OD600 值分別達到3. 10 和1. 39 時,由畫線法可測得LB 液體培養(yǎng)基中的菌濃度達到107 CFU·mL - 1 。將分別含有2 株菌的LB 液體培養(yǎng)基按1∶ 1 體積比混合 ,離心并撇除上清液,加入PBS 緩沖液沖洗3 次,其菌含量約為1 gMLVSS·L - 1 。

　　復合菌劑的負載:將分別含有2 株菌的LB 液體培養(yǎng)基按1∶ 1 體積比混合,同時加入邊長為1 cm 的聚氨酯立方體1 g,在25 ℃ ,150 r·min - 1 的條件下培養(yǎng)12 h 即完成了復合菌劑的固定化,取出聚氨酯立方體,用PBS 緩沖液沖洗3 次,其負載量約為0. 8 g MLVSS·g - 1 。

　　1. 2 實驗裝置及運行

　　實驗采用的SBR 裝置(見圖1)呈圓柱體,由有機玻璃制成,有效高度為70 cm,內(nèi)徑為19 cm,有效容積為5 L;反應器底部設有微孔砂盤曝氣器,曝氣量由轉子流量計調(diào)節(jié);反應器上方設有攪拌器;反應器進水、出水、曝氣及攪拌均通過時控開關自動完成,而排泥則通過手動完成。

　　3 個平行運行的SBR 中R1 和R2 作為實驗組,分別投加復合菌劑和負載復合菌劑的填料進行生物強化,R3 作為對照組只保持相同生物量的活性污泥。3 個SBR 的水力停留時間(HRT)均為12 h,排水比為1 /2,其中每個循環(huán)6 h,包括進水0. 5 h,缺氧反應1 h,好氧反應3 h,排水0. 5 h 以及閑置0. 5 h。污泥濃度(MLSS)控制在3 500 ~ 5 500 mg·L - 1 ,好氧反應末端溶解氧(DO)控制在6 ~ 8 mg·L - 1 ,溫度為25 ~ 28 ℃ 。

　　1. 3 接種污泥與實驗用水

　　實驗所用活性污泥取自市政污水處理廠的二沉池。實驗用水取自生態(tài)環(huán)境研究中心家屬區(qū)生活污水,投加粗鹽配成鹽度為3% ~ 5% 的高鹽生活污水,原生活污水常規(guī)水質(zhì)指標見表1。

　　1. 4 DNA 提取及群落結構分析

　　DNA 提取與PCR 擴增:4 mL 污泥樣品10 000 r·min - 1 離心10 min。使用Fast DNA SPIN for Soil 試劑盒(MP Biomedical, France)按提取說明操作。提取的DNA 在Nanodrop 分光光度計(Nanodrop, USA)上測定DNA 的濃度和質(zhì)量,并使用1% 瓊脂糖凝膠電泳驗證DNA 的完整性。采用PCR 對16S rRNA 的V4 區(qū)進行擴增,引物為515F(5’-barcode-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’)和907R(5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’),反應條件為95 ℃ 預變性2 min;之后95 ℃ 變性30 s、55 ℃ 退火30 s、72 ℃ 延伸30 s 共循環(huán)25 次;較后72 ℃ 保持5 min。PCR 反應體系為20 μL,包括4 μL 5 × FastPfu Buffer、2 μL 2. 5 mmol·L - 1 dNTPs、0. 8μL 上下游引物(5 μmol·L - 1 )、0. 4 μL FastPfu 聚合酶和10 μg DNA 模板。

　　高通量測序與OTU 分類:采用Illumina Miseq 平臺(Illumina, USA)測序分析,測序數(shù)據(jù)經(jīng)優(yōu)化后,每個樣品含有28577 條有效序列。有效序列采用Ribosomal Database Project (RDP) 分類。Circos 圖采用Circos 軟件(http:/ / mkweb. bcgsc. ca/ tableviewer/ )繪制;主成分分析(PCA)采用Canoco 5. 0 繪制(Microcomputer,USA);熱圖(Heatmap)采用Hemi 1. 0(http:/ / hemi. biocuckoo. org/ )PCA 和熱圖是基于前含量前10 位菌屬繪制。

　　1. 5 水質(zhì)分析項目及方法

　　TOC:element 元素分析儀測定;DO:YSI550A 溶氧儀測定;pH:SartoriusPB-20 pH 計測定;TDS、MLSS、MLVSS:重量法。

　　2 結果與討論

　　2. 1 復合菌劑投加量優(yōu)化

　　采用250 mL 搖瓶實驗考察不同復合菌劑投加量的SBR 對TOC 的降解效果,從而實現(xiàn)復合菌劑投加量優(yōu)化。培養(yǎng)條件:轉速為150 r·min - 1 ,25 ℃ ;將活性污泥接種于搖瓶中,接種量為2 040 g MLVSS·L - 1 ;采用批次換水,停留時間8 h。48 h 后出水的TDS 基本穩(wěn)定,按表2 方法投加復合菌劑,并且停止換水。取樣周期為2 h,連續(xù)采樣24 h。樣品離心并過0. 45 μm 濾膜,測定TOC 值。

　　表2 反應器投菌方案

　　由圖2 可知,隨著復合菌劑投加量的增加,投加復合菌劑的生物強化系統(tǒng)(bio-augmentation system,BS)的TOC 降解速度逐漸加快,較大降解率也有所增強。投加1% 、5% 、10% 和15% 復合菌的由于投菌量由10% 增加到15% ,TOC 去除速率與較大去除率均沒有顯著提高,說明投菌量增加到一定程度后,對系統(tǒng)降解速度和降解效果影響變化不大,所以反應器運行選擇10% 投菌量。

　　2. 2 復合菌劑對SBR 啟動的影響

　　反應器啟動共分為3 個階段。個階段(1 ~ 15 d),反應器中接種城市污水處理廠活性污泥,接種量約為2 000 mg MLVSS·L - 1 ,并采用普通生活污水作為進水,直到3 個SBR 的TOC 去除率均穩(wěn)定達到85% 以上;第二個階段(16 ~ 25 d),采用高鹽生活污水作為進水,進行復合菌劑與投加,對R1和R2 每隔1 d 各自投加10% × MLVSS 的復合菌劑和菌填料,共投加5 次;第三個階段(26 ~ 45 d),保持SBR 的正常運行直到R1 和R2 的TOC 去除率再次穩(wěn)定達到85% 以上。

　　從圖3 可以看出,在SBR 處理高鹽生活污水啟 動期,投加復合菌劑及菌填料對SBR 的TOC 去除率有非常顯著的提高 ,第15 天到25 天,復合菌劑投加過程中,R1、R2 的TOC 去除率能夠穩(wěn)定在80% 左右,而R3 的TOC 去除率僅僅從25% 提升至40% ;第26 天至45 天,SBR 運行過程中,R3 的TOC去除率并沒有顯著的提高,直到40 d 才出現(xiàn)緩慢提高的趨勢。第35 天以后,R1 和R2 的TOC 去除率均可以穩(wěn)定在85% 左右,可認為SBR 處理高鹽生活污水啟動完成 ,而直到65 d,R3 的TOC 去除率僅為65. 3% 。此外,對比R1 和R2,在第二階段的出水TOC 呈現(xiàn)出一致性,而在第三階段,R2 的運行狀況明顯更加穩(wěn)定,這也說明投加負載菌填料能夠為復合菌劑提供更加穩(wěn)定的環(huán)境,懸浮填料表面即可觀察到一層褐色黏膜附著,證明微生物開始附著生長,生物膜逐漸形成。SBR 快速啟動過程中MLSS 及MLVSS 的變化規(guī)律如圖4 所示。R1、R2 和R3 的MLSS 及MLVSS 整體均呈現(xiàn)出先下降,后上升的趨勢。這是由于起初活性污泥微生物受到高鹽度的抑制甚至毒害,導致生物量降低,而隨著污泥的馴化,嗜鹽微生物逐漸開始增殖。值得一提的是R2 的MLSS 劇減,可能是由于投入填料后,部分微生物附著在填料上,從而導致反應器內(nèi)懸浮固體濃度減少。此外,R1、R2 和R3 MLVSS/ MLSS 的值由0. 068 5 分別降低至0. 623、0. 624 和0. 561,有研究證明高鹽廢水下的活性污泥絮體致密、沉降性能好,這可能是鹽在嗜鹽微生物體內(nèi)富集導致的。

　　2. 3 SBR 群落結構分析

　　對SBR 中活性污泥進行了高通量測序用于揭示反應器菌群結構演替以及復合菌劑的存留狀況。群落結構分析的4 組實驗包括配入高鹽廢水前期(R1、R2 和R3 完成接種后在相同條件下運行,樣品編號Rday15),連續(xù)投加復合菌劑的R1 組(樣品編號R1 day25、R1 day35、R1 day45),連續(xù)投加復合菌劑的固定化填料的R2 組(樣品編號R2 day25、R2 day35、R2 day45);連續(xù)投加活性污泥的R3 組(樣品編號R3day25、R3 day35、R3 day45)。不同處理組及采樣階段,菌門水平變化如圖5 所示?；钚晕勰辔⑸镏泻枯^多的為變形菌門( Proteobacteri) 和擬桿菌門( Bacteroidetes),其所占比例較高,分別達到40. 45% 、27. 05% 、4. 69% 和4. 22% 。在整個生物處理啟動過程中,高鹽廢水對活性污泥的馴化以及復合菌劑的投入使活性污泥微生物群落結構發(fā)生了明顯的改變?；钚晕勰嘀兄饕⑸锉壤l(fā)生了明顯改變,R1、R2 和R3 中變形菌門所占比例均出現(xiàn)驟增,分別達到56. 24% 、56. 22% 和63. 72% ,擬桿菌門所占比例則分別降低至16. 11% 、19. 40% 和17. 68% 。對于R1 和R2,從運行第10 天至15 天連續(xù)投加了復合菌劑和負載復合菌劑的填料,所以R1 和R2 中厚壁菌門所占比例從1. 31% 分別升高至6. 13% 和4. 54% ;對于R3,由于僅投入活性污泥種泥,其中的厚壁菌門所占比例在運行45 d 僅有0. 95% 。這說明地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) O1 和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) Y5 所屬的厚壁菌門雖然具有較強的耐鹽性,但不具備競爭優(yōu)勢,通過復合菌劑投加,可以在活性污泥總富集,并成為優(yōu)勢種屬。

　　4 組實驗的微生物群落結構熱圖和主成分分析是基于各樣品中含量前10 位菌屬共計34 種菌屬(如圖6 和7 所示)。根據(jù)主成分分析的聚類結果,可以將R1 和R2 的啟動分為3 個階段,這與反應器運行的狀況相吻合。階段(1 ~ 15 d),反應器中活性污泥還處于適應期,進水為普通生活污水,主要以變形菌門中,如不動桿菌屬(Acinetobacter)、布蘭漢氏菌屬(Alkanindiges)、嗜門菌屬(Methylophius)和生絲微菌屬(Hyphomicroblum)等占優(yōu)勢;第二階段(15 ~ 25 d),開始以高鹽廢水為進水,此時鹽度的沖擊負荷使得微生物群落結構反生改變,變形菌門中的微生物豐度進一步增加,并達到較大豐度;第三階段(25 ~ 45 d),經(jīng)過一段時間的運行和馴化,擬桿菌門中,如鳥桿菌屬(Gelidibacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、碳酸噬胞菌屬(Aequorivita)等逐漸成為優(yōu)勢種屬,而變形菌門中的微生物豐度下降。有趣的是,由于復合菌劑和菌填料的投加,第二階段芽孢桿菌屬(Bacillus) 的豐度上升,并在之后的運行中逐漸成為優(yōu)勢種屬,而這一階段R1 與R2 對TOC 的去除率也遠高于R3,因此,復合菌劑的投加對改善生物工藝有機物去除效果,縮短啟動時間具有顯著的效果。

　　3 結論

　　1)O1 和Y5 兩株菌均具有很強的耐鹽能力,能夠在高鹽環(huán)境下生存,并且通過復配能夠獲得較高的有機物降解率。投菌量由10% 增加至15% ,達到相同TOC 去除率的時間沒有大幅度縮短,較大去除率也沒有提高,說明投加量增加到一定程度后,對系統(tǒng)降解速度和降解效果影響變化不大。

　　2)實驗組經(jīng)連續(xù)多次投加耐鹽高效菌制備的復合菌劑的SBR 能夠在30 d 完成快速啟動,并且在啟動過程中,TOC 的去除率都能夠穩(wěn)定保持在80% 左右。此外,通過投加負載復合菌劑的菌填料進行生物強化,能夠獲得更長的時效行,并且具備更強的抗沖擊負荷的能力?；谳^好的有機污染物出去效果和較強的抗鹽度沖擊能力,本研究制備的復合菌劑用于改善生物處理工藝啟動期TOC 的去除率,縮短生物處理工藝的啟動時間具有顯著的效果。若能夠進一步與耐鹽硝化菌和耐鹽反硝化菌復合,制備多種功效的復合菌劑,在強化TOC 去除的基礎上,強化生物工藝的總氮去除效果,將更具有實際應用價值和工程意義。

　　3)實驗結果表明復合菌劑的引入導致系統(tǒng)內(nèi)菌群競爭優(yōu)勢的變化,使整個系統(tǒng)快速適應水質(zhì)變化,處理效率提高,而通過啟動完成后的生物群落結構分析可以看到所投加的耐鹽高效菌O1 和Y5 在活性污泥微生物總量中所占比例由1. 31% 升高至6. 13% ,說明O1 和Y5 能夠在小試SBR 中長期存留,并逐漸成為優(yōu)勢種屬之一。